在作物基因编辑与分子育种研究中，传统原生质体转化体系存在操作难度大、物种依赖性强等问题，严重制约了基因编辑载体的高效前期筛选。毛状根转化被视为理想的替代方案，但长期缺乏统一、稳定、跨物种适用的标准流程。

近日，北京大学现代农业研究院与中国农业科学院生物技术研究所张华伟团队成功突破这一技术瓶颈，建立了适用于绝大多数双子叶植物的通用毛状根转化体系。相关研究成果以“A universal hairy root transformation protocol for evaluating editing efficiency in dicot plants”为题，在 《Modern Agriculture》 期刊正式发表。

一、研究背景：初始探索与问题发现

研究团队最初尝试在穿心莲中建立毛状根体系，以DsRed为荧光标记，测试了K599、MSU440、Ar.1193、Ar.Qual和C58C1五种常用发根农杆菌菌株，选用10日龄幼苗的子叶和下胚轴作为外植体。经过2天共培养和14天无筛选培养后，所有菌株均未诱导出DsRed阳性毛状根。

团队随后尝试一步法转化（去除10日龄幼苗的根和部分下胚轴，将茎段切口蘸取菌体后栽入无菌蛭石），同样未获得转基因毛状根。由此推测，10日龄幼苗可能已偏老，不利于毛状根诱导。

二、核心发现：外植体年龄是关键变量

研究重新测试了1日龄、2日龄和3日龄穿心莲幼苗。将幼苗根部切除，上部茎段切口接种不同菌株，2天共培养后转入1/2 MS培养基。14天后结果显示：K599、MSU440、Ar.1193和Ar.Qual均能在1日龄或2日龄材料中诱导DsRed阳性毛状根，而3日龄材料中未检测到阳性结果。

在所有菌株中，K599表现最优。使用1日龄穿心莲幼苗时，K599诱导的毛状根转化效率最高达到36.67%。这一结果说明：幼苗年龄直接决定毛状根诱导成败，K599在穿心莲中具有更高转化能力。

三、模式植物验证：拟南芥中的规律一致性

为验证上述规律是否适用于模式植物，团队将体系扩展到拟南芥。由于1日龄拟南芥幼苗过小、操作困难，研究选择2日龄幼苗作为最年轻处理，并设置4、6、8、10日龄材料作为对照。

结果与穿心莲一致：K599仍是最高效菌株。在2、4、6、8、10日龄拟南芥外植体中，K599转化效率分别为91.03%、75.56%、42.49%、6.80%和8.19%，其他菌株效率明显较低。随着幼苗年龄增加，毛状根形成效率快速下降。

四、跨物种验证：四种作物的测试结果

团队进一步测试了四种双子叶作物：油菜、莴苣、番茄和辣椒，分别代表十字花科、菊科和茄科。由于这些作物1日龄幼苗便于操作，研究直接比较1、2、3日龄幼苗，统一使用K599菌株。

14天后统计显示，四种作物均以1日龄外植体效率最高：油菜93.44%、莴苣98.31%、番茄78.07%、辣椒61.23%。但不同物种对外植体年龄的敏感性不同：莴苣在1-3日龄均保持90%以上效率；油菜和辣椒随年龄增加逐步下降；番茄最为敏感，2日龄和3日龄效率较1日龄下降约95%。

结论：除拟南芥因材料过小采用2日龄外，多数双子叶植物应优先选择1日龄幼苗。

五、普适性验证：覆盖10个科12种植物

基于上述结果，团队设计了通用毛状根转化流程：选择1日龄幼苗，切除根部，在茎根交界附近接种K599菌液，无抗筛选条件下培养形成毛状根。

为评估普适性，研究继续测试了6种双子叶植物：苋菜、空心菜、秋葵、西瓜、花生、丹参，覆盖苋科、旋花科、锦葵科、葫芦科、豆科和唇形科。结果显示，6种植物均能获得DsRed阳性毛状根，转化效率分别为36.55%、35.55%、78.70%、79.76%、23.45%和75.85%。

至此，该体系已在12种双子叶植物、10个科中完成验证，证明K599配合年轻幼苗外植体具有较好的跨物种适用性。

六、应用拓展：基因编辑载体效率检测

建立通用转化流程后，团队将其应用于基因编辑载体效率检测，设计了三种检测方式：

Sanger测序：使用pZDK672载体（SpCas9和sgRNA均由双35S启动子驱动），在拟南芥、油菜、莴苣、番茄和辣椒中针对13个基因设计1-3个靶点，通过K599递送编辑载体。每个靶点选取10条转基因毛状根进行Sanger测序，并引入DsRed作为可视化筛选标记。

PCR/限制性酶切分析：选择莴苣LsPDS基因中含BglII位点的靶点，通过PCR扩增和酶切判断目标位点是否发生突变。

Hi-TOM测序：对17个靶点的PCR产物进行高通量测序，获取更全面的编辑频率和突变类型信息。

从种子萌发到毛状根形成再到靶点活性检测，Sanger测序和PCR/RE方案可在3周内完成；Hi-TOM测序需额外增加约1周。

七、稳定性验证：与稳定转化体系的一致性

为验证毛状根体系能否反映稳定转化中的编辑表现，团队测试了莴苣稳定转基因植株中LsPDS-T1靶点的编辑效率。结果显示，稳定转基因莴苣中的编辑效率为53.33%，与毛状根体系中检测到的编辑活性具有对应关系，稳定编辑植株表现出PDS突变相关表型。

八、研究总结

该研究建立了一套以K599菌株和年轻幼苗外植体为核心的双子叶植物通用毛状根转化体系：

拟南芥推荐使用2日龄幼苗。

其余测试双子叶植物优先使用1日龄幼苗。

该体系已在12种双子叶植物中验证，可在最短3周内通过Sanger测序、PCR/限制性酶切或Hi-TOM测序评估编辑载体效率，为组织培养前的载体筛选提供了快速检测平台。

研究团队与资助

·通讯作者：张华伟 研究员（北京大学现代农业研究院 / 中国农业科学院生物技术研究所）

·第一作者：杨红 助理研究员（北京大学现代农业研究院）

·共同作者：焦益壤（科研助理）、孙文静（副研究员）、朱涛涛（助理研究员）、郭娟 研究员（中国中医科学院）

该研究得到了 泰山学者项目、山东省自然科学基金 等项目的资助。

原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/moda.70037

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