Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶）是植物光合作用中固定CO₂的关键酶，但其催化效率低下，长期被视为作物产量提升的瓶颈。Rubisco由叶绿体基因组编码的大亚基（RbcL）和核基因组编码的小亚基（RbcS）共同组装而成，同时需要Rubisco活化酶（Rca）维持活性。这种复杂的多基因协同表达模式，给Rubisco的工程化改造带来了巨大挑战。

近日，德国马克斯·普朗克分子植物生理学研究所Ralph Bock团队在 《The Plant Journal》 上发表研究，利用多重CRISPR-Cas9基因编辑技术，在二倍体烟草（Nicotiana sylvestris）中成功敲除了Rubisco相关的全部核基因位点，为异源Rubisco系统的导入提供了一个“干净”的受体底盘。

一、靶基因家族鉴定

研究团队首先在林烟草基因组中完成了靶基因家族的系统鉴定：

· RbcS基因家族：鉴定出6个主要在叶肉细胞中表达的小亚基编码基因位点

· Rca基因家族：鉴定出3个Rubisco活化酶编码基因位点需要敲除的目标基因共计9个位点。

二、多重CRISPR-Cas9载体构建

为实现对两个基因家族多个位点的同步敲除，团队设计了包含4个单链引导RNA（gRNA） 的多重CRISPR-Cas9表达载体：

· 分别靶向RbcS家族和Rca家族的高度保守编码区

· 利用家族成员序列保守性，以有限gRNA数量覆盖9个靶位点

这一策略显著提高了多基因家族敲除的效率。

三、多轮再生筛选与基因型分析

通过农杆菌介导的遗传转化，研究人员采用多轮叶片外植体愈伤组织诱导与芽再生循环，逐步富集编辑事件。测序分析证实，最终获得的突变株系（命名为Nsyl-RL）在所有9个靶向基因位点上均产生了功能丧失型突变——部分位点为纯合突变，部分为双等位基因复合杂合（两个等位基因均存在移码或提前终止的插入/缺失突变），实现了目标基因家族的彻底敲除。

四、蛋白水平验证与生理表型

免疫印迹分析显示，Nsyl-RL株系的总可溶性蛋白中无法检测到Rca和RbcS蛋白的表达信号。值得注意的是，尽管叶绿体基因组中的rbcL基因仍然完整，但由于缺乏小亚基进行全酶组装，游离的RbcL蛋白在叶绿体基质中迅速被蛋白水解酶降解，表现为大亚基蛋白信号的同步缺失。

生理表型上，该突变株系完全丧失光能自养能力，在体外培养时必须依赖外源蔗糖供应。这确认了Rubisco核基因组分已被彻底破坏，功能性Rubisco复合体无法组装。

五、总结与展望

该研究在Nicotiana sylvestris中成功创制了缺乏内源Rubisco核基因组分的突变株系，为异源Rubisco系统的导入与功能验证提供了无内源背景干扰的植物受体材料。在缺乏内源亚基竞争装配的情况下，该株系可用于系统性评估其他物种异源Rubisco复合体及Rubisco活化酶的催化动力学与调节特性。这一研究工具的开发，简化了Rubisco工程的操作流程，为未来提高光合作用碳同化效率和作物产量的分子改良研究奠定了重要基础。

原文链接

Generation of a recipient line for Rubisco engineering by multiplex genome editing in tobacco - Silva - 2026 - The Plant Journal - Wiley Online Library

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