马铃薯是全球第四大粮食作物，其块茎形成受复杂的信号网络调控。其中，BEL5转录因子长期被认为是块茎形成的核心正调控因子——它的移动性RNA从叶片运输到匍匐茎，启动块茎发育。然而，BEL5的完全敲除在马铃薯中从未实现，其真实功能一直依赖过表达或RNAi间接推断。

2026年7月，查理大学Petra Mašková团队在 bioRxiv 发表研究，首次在四倍体栽培马铃薯cv. Désirée中实现了BEL5的完全基因敲除，并发现了一个意外结论：BEL5敲除并不阻止块茎形成，仅延迟其起始时间，最终产量与野生型无显著差异。

为什么BEL5敲除如此困难？

栽培马铃薯是高度杂合的四倍体（4×），这意味着每个基因都有4个等位基因。要实现完全敲除，必须4个等位基因全部突变，且由于马铃薯无性繁殖，无法通过自交分离获得纯合后代。

研究团队选择了cv. Désirée（商用栽培品种）。当时其单倍型解析基因组尚未公开，团队利用公开的Illumina短读长数据，成功组装出4个BEL5等位基因的序列。他们设计了两个靶向第1和第4外显子的gRNA，均含有限制性内切酶识别位点，便于后续CAPS筛选。

两个关键设计

设计一：农杆菌介导稳定转化，利用“重复再生”提升编辑效率

团队通过农杆菌转化获得50个T0转基因株系。CAPS筛选显示，仅1个株系（line 60）在gRNA2位点实现完全编辑。他们对line 60进行第二轮离体再生（从叶片再次诱导芽再生），原因在于：

· 离体再生伴随染色质重塑和表观遗传重编程，可能提高Cas9对靶位点的可及性。

· 在T1后代中，出现了全新的突变（未在T0中检测到），其中5个株系（60-4、60-5、60-25、60-28、60-37）gRNA1位点被完全编辑。

设计二：多层验证策略，确保“完全敲除”不遗漏任何等位基因

团队采用CAPS初筛→Sanger+TIDE分析→Nanopore全长测序的三级验证体系。Nanopore长读长测序的高深度覆盖使团队能够检出极低比例的未编辑等位基因（如line 60-37中约六分之一的allele1仍为野生型），从而避免了假阳性。

表型结果：延迟起始，不减产量

在短日诱导水培条件下，野生型在28 DAT（移栽后天数）全部开始结薯；而BEL5敲除株系仅20-80% 的植株结薯，差异显著。但到35 DAT时，除line 60-25外，其余敲除株系的结薯数和单薯重逐渐追赶上来。最终产量无显著差异。

在长日土壤种植条件下（模拟自然生长），所有敲除株系的总产量和薯块数量与野生型相比均无显著差异。

科学启示：BEL5是“加速器”，不是“开关”

过去在安第斯亚种中的研究表明BEL5是块茎形成的关键正调控因子，其功能缺失应导致结薯障碍。而本研究在栽培品种Désirée中发现BEL5敲除仅造成轻微延迟，最终产量不受影响。这一差异提示：

· 现代栽培马铃薯的块茎形成调控网络更加稳健，存在冗余机制

· 另一关键信号分子SP6A可能在BEL5缺失时部分代偿其功能

· 基因型依赖性效应在块茎形成调控中不可忽视——安第斯亚种与栽培品种的调控逻辑可能存在本质差异

总结与技术启示

该研究为多倍体无性繁殖作物的基因编辑提供了三方面技术参考：

· 重复离体再生可有效富集编辑事件并诱导新突变

· 多层验证策略（CAPS初筛→Sanger+TIDE分析→NGS高深度测序）是确认完全敲除的必要手段

· 长读长测序可检测低丰度未编辑等位基因，避免假阳性

原文信息： Zounková A., Čermák D., Přibylová A., et al. CRISPR-Cas9-mediated knockout of BEL5 reveals its role in timing of tuber onset but dispensability for tuber yield in tetraploid potato. bioRxiv, 2026. DOI: 10.1101/2026.07.21.739726

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