茶树（Camellia sinensis）作为全球重要的经济作物，其遗传转化长期受制于两大难题：多酚类物质含量高导致外植体褐化与细胞死亡，且多酚具有杀菌活性，干扰农杆菌的附着与侵染。因此，农杆菌介导的茶树遗传转化成功案例屈指可数。

近日，山东农业大学李敏团队在 《Planta》 发表论文Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transient transformation of low-polyphenol callus from tea plant (Camellia sinensis (L.) Kuntze)，以茶树品种‘福鼎大白茶’为材料，通过黑暗培养诱导低多酚愈伤组织，并结合转化条件的系统优化，成功建立了高效农杆菌介导的茶树愈伤转化体系，转化效率高达77.53%，并实现了外源基因的稳定过表达。

关键突破：黑暗培养+TDZ诱导低多酚愈伤

茶树叶和茎段外植体在光照下诱导的愈伤组织呈绿色、质地坚硬，多酚含量高；而在黑暗条件下诱导的愈伤组织呈白色、质地松散。茎段外植体的愈伤诱导率（暗培养64.09%，光照79.71%）显著高于叶片（暗培养42.39%，光照57.19%），因此茎段是更优的外植体材料。

更为重要的是，黑暗培养显著降低了愈伤组织的多酚含量——较光照培养降低31.7%–70.76%，为农杆菌侵染创造了有利条件。

在愈伤增殖阶段，团队筛选了多种激素组合。用TDZ（噻苯隆） 替代传统的6-BA后，愈伤增殖效率显著提升——含2.0 mg/L TDZ + 0.2 mg/L IAA的MS培养基在黑暗条件下增殖率达5.99，且愈伤组织质地柔软松散，最适合作为转化受体。

转化条件系统优化：77.53%的转化效率如何实现

团队以含GUS报告基因的pBI121-CsCLH1过表达载体为测试工具，系统优化了抗生素浓度和乙酰丁香酮（AS）浓度两个关键参数。

抗生素浓度筛选：

在100 mg/L卡那霉素+50 mg/L羧苄青霉素组合下，愈伤存活率最高（86.55%），转化效率达72.82%。卡那霉素浓度过低（0-50 mg/L）无法有效抑制农杆菌，导致细菌过度生长、愈伤死亡；浓度过高（150 mg/L）则严重抑制愈伤生长（转化率仅1.85%）。羧苄青霉素的加入有效控制了农杆菌的残留生长，但过高浓度（100 mg/L）同样会降低转化效率。

乙酰丁香酮浓度优化：

在侵染液中添加100 μmol/L AS时转化效率最高（77.53%），较不加AS（70.31%）提升约7个百分点，较50 μmol/L（73.49%）和150 μmol/L（54.83%）均具有显著优势。AS作为农杆菌vir基因的诱导物，其浓度过低不足以充分激活vir基因表达，过高则可能产生细胞毒性。

转基因愈伤的多层次验证

团队通过抗生素筛选+GUS组织化学染色初步鉴定转基因愈伤（整块愈伤组织呈现均匀蓝色），随后从DNA、RNA和蛋白质三个层面进行了系统验证：

DNA水平：PCR扩增证实35S-CsCLH1融合基因已整合至‘福鼎大白茶’愈伤基因组中（图S1）；

RNA水平：半定量RT-PCR和RT-qPCR均证实转基因愈伤中CsCLH1的表达量显著高于非转化对照；

蛋白质水平：Western blotting使用GFP抗体检测到特异性条带，证实CsCLH1蛋白在转基因愈伤中成功表达。

茶树转化的难点与突破

茶树遗传转化的核心障碍——多酚类物质——通过黑暗培养策略得到了有效缓解。黑暗条件下，茶愈伤组织的多酚合成途径被抑制，不仅降低了对外植体的毒性，也减少了其对农杆菌的杀菌效应。此外，TDZ在茶树愈伤增殖中的优异表现（优于6-BA）也为其他木本植物的组织培养提供了参考。

目前该体系的局限性在于：转基因愈伤尚无法再生成完整植株。茶树离体再生极为困难，非胚性愈伤的分化能力极弱，胚状体诱导效率极低，且转化细胞往往表现出生长和发育能力的减弱——这是目前全球茶树遗传转化面临的共同瓶颈。尽管如此，愈伤组织本身已是茶树次生代谢研究（多酚、茶氨酸、咖啡因生物合成）和基因功能分析的理想材料，该体系的建立为茶树的分子生物学研究提供了重要的技术支撑。

总结

该研究通过在黑暗条件下利用茎段外植体和TDZ诱导低多酚愈伤组织，并结合100 mg/L卡那霉素+50 mg/L羧苄青霉素+100 μmol/L AS的转化条件组合，成功建立了茶树愈伤组织高效农杆菌转化体系（77.53%），并实现了CsCLH1的稳定过表达。这一体系为茶树的基因功能研究、次生代谢调控和基因编辑提供了可靠的技术平台。

原文信息： Wang Y., Li M.L., Li J.Y., et al. Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transient transformation of low-polyphenol callus from tea plant (Camellia sinensis (L.) Kuntze). Planta, 2026, 264: 74. DOI: 10.1007/s00425-026-05090-z

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