CRISPR/Cas9基因编辑后的突变筛选，长期以来面临一个尴尬的局面：T7E1等酶切法灵敏度低、操作繁琐；Sanger测序通量低、成本高；专用HRM试剂盒和仪器价格昂贵。对于很多实验室而言，如何快速、低成本地鉴定编辑阳性植株，始终是一个现实难题。

近日，巴西圣保罗大学Fabienne Micheli团队在《New BIOTECHNOLOGY》发表研究Easy detection of CRISPR/Cas9-induced insertions, deletions, and substitutions in rice genes OsMADS26, OsRAC1 and OsNRT1.1b using SYBR Green qPCR and robust HRM analysis in R software，该团队开发了一种基于常规SYBR Green qPCR的HRM分析方法，结合自定义R脚本进行熔解曲线解析，成功检测了水稻OsMADS26、OsRAC1和OsNRT1.1b三个基因中CRISPR/Cas9诱导的插入、缺失和碱基替换三种突变类型，并在编辑/野生型DNA混合实验中检测到低至1%的编辑DNA。

研究背景

CRISPR/Cas9编辑后，突变筛选通常依赖Sanger测序或T7E1酶切法。但Sanger测序成本高、通量低，T7E1灵敏度有限且依赖异源双链形成。高分辨率熔解曲线分析（HRM）通过检测PCR扩增子的熔解行为变化来识别序列变异，灵敏度高、通量大。然而，专用HRM试剂（如EvaGreen、SYTO 9）和专用仪器（如LightScanner）价格不菲，限制了其在资源有限实验室的普及。

本研究旨在回答一个问题：能否用常规SYBR Green qPCR和常规qPCR仪器，配合开源分析工具，实现同样可靠的突变检测？

研究方法

研究选取了三种不同突变类型的水稻编辑材料：

OsMADS26：单碱基插入（A），纯合突变（Nipponbare背景）

OsRAC1：1-2 bp缺失，杂合突变（Kitaake背景）

OsNRT1.1b：C→T碱基替换，纯合突变（Kitaake背景，由BE3碱基编辑器产生）

团队设计了针对三个基因编辑位点的短片段引物（扩增子大小120-164 bp），在常规LightCycler 96仪器上使用SYBR Green qPCR mix进行扩增和熔解曲线采集。随后将原始荧光数据导出，通过自定义R脚本进行标准化、导数计算和聚类分析。

核心数据分析指标：

结果：三种突变类型均被清晰区分

OsMADS26（A插入）：野生型Tm约87.4°C，编辑型约86.6°C。衍生熔解曲线、归一化曲线和差异图均将两组样本完全分离，层次聚类形成两个独立分支（图1）。Welch t检验显示Tm差异极显著（p=6.6×10⁻⁵）。

OsRAC1（1-2 bp缺失，杂合）：野生型Tm约85.10°C，编辑型约85.80°C。尽管Tm差异较小，但曲线形状的差异仍使两组样本在差异图和聚类分析中完全分离（图1）。杂合样本的成功区分是本研究的一个重要亮点。

OsNRT1.1b（C→T替换）：野生型Tm约92.4°C，编辑型约91.5°C。在28个编辑样本和4个野生型样本的筛选中，层次聚类将两组完全分离。PERMANOVA分析显示两组间整体熔解曲线结构差异显著（F=35.725, p=0.001）。

灵敏度测试：1%编辑DNA即可检测

团队将编辑DNA与野生型DNA按1%、5%、10%、25%、50%、70%比例混合，模拟编辑植株中不同比例的编辑等位基因。结果：含有1%编辑DNA的混合物即可观察到与野生型对照的熔解曲线偏差，且随着编辑DNA比例增加，曲线逐渐向编辑型偏移。这提示该方法灵敏度极高，足以检测低丰度编辑事件。

与传统方法的比较

该方法的定位非常明确：作为测序前的初步筛选工具，帮助研究者从大量转化体中快速锁定候选编辑植株，大幅减少Sanger测序的工作量。

技术优势与局限

优势：

成本低廉：无需专用HRM染料和专用仪器，常规SYBR Green和常规qPCR仪器即可

开源灵活：R脚本完全开放（GitHub: Donandrade/authenticationANDdiagnostics），用户可自定义输入格式、分组定义、图形标签等

高灵敏度：可检测低至1%的编辑DNA

三种突变类型全覆盖：插入、缺失、替换均有效

局限：

不能替代测序：无法提供突变的具体序列信息

需要参考对照：必须同时运行野生型对照

引物设计需优化：扩增子最好在100-200 bp之间，以获得最佳分辨效果

总结

该研究为CRISPR编辑植物的突变筛选提供了一种低成本、易操作、高灵敏的新方案：将常规SYBR Green qPCR的熔解曲线数据通过开源R脚本进行深度解析，有效区分了水稻三个基因中三种类型的CRISPR诱导突变。该方法填补了T7E1（低灵敏）和Sanger测序（低通量）之间的技术空白，尤其适合资源有限但需要高通量筛选的实验室。

原文信息： Reis B.C.C., Georget C., Meunier A.-C., et al. Easy detection of CRISPR/Cas9-induced insertions, deletions, and substitutions in rice genes OsMADS26, OsRAC1 and OsNRT1.1b using SYBR Green qPCR and robust HRM analysis in R software. New BIOTECHNOLOGY, 2026. DOI: 10.1016/j.nbt.2026.07.005

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