丹参（Salvia miltiorrhiza）是治疗心脑血管疾病的重要中药材，其活性成分丹参酮的生物合成途径尚未完全解析，而传统的遗传转化方法周期长、依赖组织培养，严重制约了丹参的功能基因组学研究。

2026年8月，山东农业大学王超阳、刘江斌等人在 《The Plant Journal》 发表研究，开发了一种无需组织培养的“下胚轴针刺法” ，在非无菌条件下即可完成农杆菌介导的基因递送，转化效率达55%，CRISPR/Cas9编辑频率达53.8%–88.9%。

1. 方法核心：一针穿透，绕过组培

传统转化方法需要经过愈伤诱导、再生和反复继代培养，流程繁琐且周期长。下胚轴针刺法的思路完全不同——直接在完整幼苗的下胚轴处进行针刺接种，完全绕过了这些步骤。

操作流程简洁明了：丹参种子萌发10天后，用针刺穿下胚轴并注入农杆菌悬液（OD₆₀₀≈1.0），短暂浸泡后移栽至营养基质中。接种约2周后，EGFP阳性转基因根即可出现。经过约4个月的培养，转基因根系达到目标鲜重（≥3.0 g）后，切取根段诱导芽再生，约1个月即可获得转基因植株，全程约5个月。

2. 转化体系系统优化

研究系统评估了农杆菌菌株、侵染液和OD₆₀₀三个关键因素。结果表明，菌株和侵染液对转化效率有显著影响（P<0.01），而OD₆₀₀值的影响不显著。

K599菌株在Solution 2条件下转化效率最高，达85%，但其诱导的根系形态异常——感染部位产生大量细密缠绕的根，不适合后续培养和表型分析。ACCC10060菌株在Solution 2、OD₆₀₀=0.9条件下转化效率约55%，诱导的根系具有清晰的主根和规则的侧根，形态正常。综合转化效率和根系形态，ACCC10060被确定为最优菌株。

针刺后幼苗存活率为70%–85%，对照组为90%–100%，表明该方法对幼苗的胁迫有限。

3. 基因编辑验证

研究以TFL1（花期调控基因）为靶标评估编辑效率。在两个独立实验中，四个gRNA靶点的突变频率为53.8%–88.9%。靶向Nanopore测序未检测到脱靶突变，证明CRISPR/Cas9系统的高靶向保真度。

进一步靶向SmCPS1（丹参酮生物合成关键限速酶基因），编辑植株的根系颜色发生明显改变——与野生型的深红色相比，编辑株系呈现浅橙黄色。HPLC分析显示编辑根中丹参酮积累显著降低，多个主要化合物色谱峰消失，验证了该平台用于功能基因验证的可行性。

4. 跨物种适用性

研究将该方法成功扩展至三种其他药用植物：

· 黄芪（Astragalus membranaceus）：转化效率25%–45%

· 桔梗（Platycodon grandiflorus）：转化效率最高达55%

· 菘蓝（Isatis indigotica）：转化效率30%–45%

此外，该方法在山东两个不同产区的丹参品种中均取得成功，百花丹参转化效率45%，紫花丹参40%，表明该方法不高度受基因型限制。

5. 总结

该研究建立的“下胚轴针刺法”具有三大核心优势：

· 无需组织培养：非无菌条件下操作，简化流程，降低人力需求

· 高效率：丹参转化效率约55%，编辑频率53.8%–88.9%，远高于已有的CDB方法（约6%–7%）

· 跨物种适用：已在四种药用植物中验证，为药用植物功能基因组学和代谢工程提供了实用平台

该方法与现有的CRISPR/Cas9系统完全兼容，未来可与碱基编辑、引导编辑等先进工具整合，进一步拓展药用植物精准育种的能力。

原文信息： Wang C., Liu J., Liu C., et al. Hypocotyl acupuncture: an efficient and practical protocol for transformation and genome editing in Salvia miltiorrhiza. The Plant Journal, 2026, 128: e71103. DOI： 10.1111/tpj.71103

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