柑橘是全球最重要的水果作物之一，但其遗传改良长期受制于传统育种周期长、效率低的问题。在基因工程层面，柑橘的遗传转化至今仍主要依赖离体组织培养——以胚轴、节间或胚性组织为外植体，需严格无菌操作，每2周继代一次，耗时数月，且再生能力高度依赖基因型。对于许多优良品种而言，转化依然是一道难以跨越的门槛。

2026年10月，华中农业大学郭文武/伍小萌团队联合美国耶鲁大学Vivian F. Irish团队在 《Horticulture Advances》 发表研究A rapid and broadly applicable in planta transformation and genome editing system involving wounded epicotyls in citrus，开发了一种基于受伤上胚轴的柑橘原位转化（in planta transformation） 与基因编辑系统。该系统通过局部递送农杆菌、植物生长调节剂和抗生素，在播种后约40天即可获得转基因植株，并在多个柑橘基因型中实现了高效转化与无转基因编辑。

1. 核心设计：把“移液枪头”变成微型培养室

传统in planta转化中，激素往往不能持续供应，抗生素也多是间歇性滴加或涂抹，导致选择压力不稳定，转化效率受限。这项研究的巧思在于，用20 μL移液枪头作为局部腔室，将整个转化过程“套”在切口上。

操作流程简洁而精准：柑橘种子播种10–15天后，幼苗长至5–7 cm，在第一片真叶下方横切，保留约2–3 cm的上胚轴。随后，将装有农杆菌悬液的枪头倒扣在切口上，使切面浸没于菌液中1小时。接着，依次更换装有琼脂糖共培养基（含乙酰丁香酮）和琼脂糖筛选培养基（含卡那霉素）的枪头，分别在黑暗高湿条件下共培养3天、筛选5天。筛选结束后移除枪头、冲洗切口，转至光照条件下再生。

这里的琼脂糖替代了MS盐作为低营养载体，既能持续、局部地释放激素和抗生素，又限制了伤口处微生物的过度繁殖，为转化和再生提供了一个稳定的微环境。

2. 激素配比是关键：13.92%的非嵌合转化效率

研究系统测试了6-BA（0.6、3.0、6.0 mg/L）与NAA（0.05、0.1、0.2 mg/L）的9种组合。结果显示，3.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA的组合表现最佳：在Carrizo枳橙的79株处理幼苗中，获得了11株非嵌合GFP阳性植株，非嵌合转化效率达13.92%。

6-BA浓度过低（0.6 mg/L）时，再生率高但转化率偏低；过高（6.0 mg/L）则显著抑制芽再生，再生率降至42.37%–56.67%。NAA浓度升高同样会抑制转化效率。这说明，激素的“恰到好处”比“越多越好”更重要。

3. 广谱适用性：6个基因型全部成功，最高18.68%

该系统在另外5个柑橘基因型中均获得成功，非嵌合转化效率分别为：‘资阳香橙’18.68%、迷你金桔11.34%、瓦伦西亚甜橙7.32%、‘Eureka’柠檬3.24%、‘Shaitan’柚2.58%。虽然不同基因型间存在差异（可能与伤口再生能力、农杆菌敏感性、激素响应和抗生素耐受性有关），但6个基因型全部获得了转基因植株，且所有再生植株在一年后仍保持可检测的GFP荧光，证明该系统具有广泛的适用性和稳定性。

4. 基因编辑与无转基因植株的获得

研究进一步以CsLMI1（调控柑橘油腺发育的关键基因）为靶标，验证了系统的编辑能力。在275株Carrizo枳橙转化苗中，63株为GFP阳性，其中46株表现出油腺缺失或减少的表型。

通过对4株代表性植株的分子鉴定，研究者发现Line #4表现出完全的油腺缺失表型，且PCR检测不到nptII和GFP序列。全基因组重测序进一步证实，未检测到任何T-DNA或载体骨架整合的证据，确认这是一株无转基因的CsLMI1编辑植株。测序结果显示其靶位点编辑效率高达93%，虽然仍存在少量野生型读段（提示嵌合），但整株表型均一，说明残留的野生型细胞不足以恢复油腺发育。

5. 再生起源：形成层是“主战场”

荧光观察揭示了再生组织的来源：在光照条件下第3天，切口表面开始膨大；第6天，GFP阳性愈伤组织首先出现在伤口处的形成层区域，而非皮层或髓部；第9–12天，这些组织逐渐发育为明显的GFP阳性芽。这表明，形成层是转化后再生芽的主要来源，也为后续优化再生效率提供了细胞学依据。

6. 总结与意义

这项研究建立了一套快速、广谱、可编辑、可获得无转基因材料的柑橘原位转化体系。其核心优势在于：播种后约40天即可获得转基因植株，大幅短于传统组培方法；通过移液枪头的局部递送，实现了激素和抗生素的持续稳定供应；在6个柑橘基因型中验证了广泛适用性；并成功获得了无转基因的CsLMI1编辑植株。

对于柑橘这类世代周期长、基因型依赖强的多年生木本果树而言，绕过组培、在完整植株上直接完成转化与编辑，不仅降低了技术门槛和人力成本，也为其他难转化木本植物的遗传改良提供了一条可借鉴的“原位”路径。

原文信息： Ren J., Yin Q., Song X., et al. A rapid and broadly applicable in planta transformation and genome editing system involving wounded epicotyls in citrus. Horticulture Advances, 2026, 4: 37. DOI： 10.1007/s44281-026-00135-5

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