酵母单杂交技术是由酵母双杂交GAL4系统衍生发展而来，是一种在体内检测DNA与蛋白质之间相互作用的强大分子生物学工具。将您感兴趣的顺式作用元件 或DNA片段（称为“诱饵”）克隆到一个报告载体上。该载体包含一个缺乏天然启动子的报告基因，最常用的是AbAr,His3。将您要筛选的转录因子或蛋白的cDNA（称为“猎物”）克隆到表达载体上，该载体带有一个激活结构域，最常见的是酵母GAL4转录因子的激活域。将构建好的“诱饵”载体转入酵母报告菌株。该菌株本身由于报告基因无法表达，在特定的缺陷培养基（如缺乏组氨酸的培养基）上不能生长。再将“猎物”载体转入含有“诱饵”的酵母菌中。如果“猎物”蛋白能够特异性结合到“诱饵”DNA序列上，其携带的激活域就会在酵母中开始转录，从而启动报告基因的转录和表达。

酵母双杂交是一种用于检测蛋白质间相互作用的经典分子生物学技术。其核心原理基于：将转录因子拆解为两个功能独立的结构域—DN结合结构域和转录激活结构域，二者单独存在时均无法启动基因转录。将一个待测蛋白质与DNA结合结构域融合，作为“诱饵”；将另一个待测蛋白质与转录激活结构域融合，作为“猎物”。当这两个蛋白质在酵母细胞核内发生特异性结合时，就会使原本分离的两个结构域在空间上重新接近，从而重建有活性的转录因子，并激活下游报告基因的表达。通过检测报告基因的产物，例如观察酵母能否在缺陷培养基上生长或是否产生颜色反应，就能间接证明蛋白质之间存在直接相互作用。

①简介：在植物核体系双杂交系统中，我司目前使用的为pGADT7与pGBKT7载体。单系统包括pABAi系统与pHis2系统。

实验流程：

质粒构建：从文库筛选得到的阳性酵母克隆中，通过提取酵母质粒并转化至大肠杆菌的方法，分离并纯化出候选的“猎物”质粒。准备对照质粒：同时准备以下关键对照质粒。阳性对照质粒：已知能与你的“诱饵”蛋白发生相互作用的“猎物”质粒（如果存在）。阴性对照质粒：已知不能与你的“诱饵”蛋白相互作用的“猎物”质粒（如空“猎物”载体或无关蛋白的载体）。

共转化：将以下质粒组合分别共转化到相同的膜体系酵母报告菌株中：实验组：“诱饵”质粒 + 候选“猎物” 质粒。阳性对照组：“诱饵”质粒 + 阳性对照“猎物” 质粒。阴性对照组：“诱饵”质粒 + 阴性对照“猎物” 质粒。“诱饵”自激活对照组：仅“诱饵”质粒 + 空“猎物”载体。“猎物”自激活对照组：空“诱饵”载体 + 候选“猎物”质粒（用于检查“猎物”本身是否会异常激活系统）。

点板验证与表型分析：这是验证的核心环节。将上述每组转化后的酵母菌液调整到相同浓度（如OD600=1.0），然后进行系列稀释（如10倍梯度稀释），分别取等量菌液点在以下几种固体培养基上：双缺培养基（DDO，如SD/-Trp/-Leu）：用于验证所有转化子都成功含有“诱饵”和“猎物”两种质粒。所有组都应正常生长。四缺选择性培养基（QDO，如SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）：这是关键判断依据。只有发生了相互作用的酵母细胞才能在这种缺乏必需氨基酸的苛刻培养基上生长。

预期结果：实验组和阳性对照组应能在QDO培养基上生长，阴性对照组、两个自激活对照组应几乎不能生长。

互作验证：为了获得更精确的相互作用强度数据，可以进行β-半乳糖苷酶活性测定。相互作用的强弱与β-半乳糖苷酶的活性成正比。

结果分析：如果实验组在QDO板上表现出与阳性对照组相似的生长能力，且β-半乳糖苷酶检测为阳性，同时所有对照组结果均符合预期（即无生长），则可以得出结论：“诱饵”蛋白与候选“猎物”蛋白在膜体系中存在特异的相互作用。

②实验周期：4-6周 

③适用场景：

1.验证已知的核蛋白质之间是否存在特异性相互作用。

2.验证已知的DNA序列与蛋白之间是否存在特异性相互作用。

④结题标准：在无自激活情况下，阴性对照组无互作，同时阳性对照组正常互作，并反馈杂交实验结果。

⑤实验交付内容：

1、诱饵质粒与猎物质粒，大肠杆菌菌液。

2、酵母单/双杂交实验图片
3、酵母单/双杂交实验报告

1、载体构建经验丰富，采用无缝克隆组装。极大节省您的研究时间。

2、为每个项目量身定制最优实验方案，无论是复杂启动子分析还是特殊物种基因筛选，我们都有信心应对。

3、建立项目专属沟通群，实验进程实时同步，数据结果清晰可溯。