单杂建库实验主要用于筛选能与特定DNA序列结合的蛋白质。首先，将目标DNA序列克隆到含有最小启动子和报告基因的载体上，并整合到酵母基因组中。然后，将一个与转录激活结构域融合的“猎物”cDNA文库导入该酵母菌株。如果文库中的某个蛋白质能够特异性结合到“诱饵”DNA上，就会将激活结构域招募到启动子附近，启动报告基因的表达。通过检测报告基因活性，就可以从庞大的文库中筛选出所需的DNA结合蛋白。

双杂建库实验则用于探测蛋白质之间的相互作用。该体系将两种待测蛋白质分别与DNA结合结构域和转录激活结构域融合表达。当“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生物理结合时，会使DNA结合结构域和激活结构域在空间上相互靠近，从而形成一个完整的转录激活因子，启动下游报告基因的表达。通过构建一个“猎物”文库，可以高通量地筛选出与已知“诱饵”蛋白相互作用的未知蛋白。

①简介： 

实验流程：

1、Total RNA的提取

1）取适量组织样品，在预冷的研钵中用液氮研成粉末，然后转入RNase free离心管中；

2）加入20mL的CTAB试剂，加入600μL巯基乙醇，振荡混匀，65℃静置30min充分裂解，每10min震荡一次；

3）加入4mL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5-10min；

4）8000×g，4℃，离心15-20min；

5）取上清至新RNase free离心管中，加入1/3体积5M氯化锂，颠倒混匀，4℃静置过夜；

6）12000×g，4℃，离心15min；

7）弃上清，加入5mL的75%乙醇（RNase free）洗涤沉淀，12000×g高速冷冻离心 5min；

8）重复步骤7）一次

9）弃上清，超净工作台中干燥RNA沉淀，然后溶解于适量DEPC水中。

2、mRNA分离

1）取上一步骤中提取的total RNA, 冰上融化放置；

2）取500μL Binding buffer B6（与RNA等体积）于65℃水浴预热；

3）小心用移液器轻轻混匀Fasttrack MAG beads, 吸取200μL beads到1.5mL RNase free离心管中；

4）将含有MAG beads的离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清（避免碰触MAG beads）；

5）将离心管从磁座上取下，马上加入500μL Wash buffer W7, 小心混匀；

6）将离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清（避免碰触MAG beads）；

7）重复步骤5）- 6）一次；

8）将离心管从磁座上取下，加入预热的Binding buffer B6和total RNA，小心混匀后65℃水浴孵育5min；

9）室温旋转颠倒混匀样品离心管10min；

10）将样品离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清；

11）重复步骤5）- 6）四次；

12）将洗涤过四次的Beads管从磁座上取下，加200μL DEPC水，小心混匀，37℃水浴2min；

13）将离心管放置在磁座上，静置1min，小心吸取上清至一个新的1.5mL离心管中（RNase free）；

14）重新在Beads管中加入100μL DEPC水，从磁座上取下，小心混匀后放置到磁座上；

15）静置1min后，小心吸取上清置于步骤13）的离心管中，将两次洗脱溶液合并，即样品的mRNA。

3、cDNA初级文库构建

1）片段和接头设计：参考参考《GATEWAY™ Cloning Technology》进行设计；

2）扩增引物设计；

3）cDNA第一链的合成；

4）cDNA第二链的合成；

5）cDNA adapter的制备；

6）cDNA与attB1重组接头连接（三份接头各连一份）；

7）cDNA分级分离；

8）BP重组；

9）电转化大肠杆菌DH10B；

10）文库克隆检测。

4、pGADT7酵母文库的构建

1）初级文库的质粒抽提；

2）文库质粒重组；

3）酵母文库质量鉴定。

②实验周期：约1-1.5月

③适用场景：

1.构建高质量单/双杂酵母文库 

2.大规模蛋白质相互作用组学研究

3. 验证蛋白间的直接相互作用

④结题标准：构建酵母单/双杂交文库 

⑤实验交付内容：

1、酵母文库质粒
2、含有酵母文库质粒的大肠杆菌

3、酵母文库构建报告与图片

1、RNA质量高，保证cDNA全覆盖。

2、重组方法高效，保证文库质量。

3、mRNA反转录，可获得完整的基因信息。