双杂建库实验则用于探测蛋白质之间的相互作用。该体系将两种待测蛋白质分别与DNA结合结构域和转录激活结构域融合表达。当“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生物理结合时，会使DNA结合结构域和激活结构域在空间上相互靠近，从而形成一个完整的转录激活因子，启动下游报告基因的表达。通过构建一个“猎物”文库，可以高通量地筛选出与已知“诱饵”蛋白相互作用的未知蛋白。

膜体系酵母双杂交筛库的实验思路是以研究蛋白为诱饵，筛选膜体系酵母双杂交文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，最终确定与研究蛋白相互作用的蛋白。

①简介： 

实验流程：

1.建库流程：

第一步：RNA提取与mRNA纯化

从目标组织或细胞中提取总RNA，并利用Oligo(dT)磁珠等方法纯化出高质量的mRNA。mRNA的质量直接决定文库的完整性和代表性。

第二步：cDNA的合成

采用SMART（Switching Mechanism at 5' End of RNA Template）等特殊技术合成双链cDNA。该技术能有效富集全长基因序列，并克服传统cDNA合成中5'端序列容易丢失的问题，这对于获得完整的蛋白质编码序列至关重要。

第三步：cDNA与“猎物”载体的连接

将合成的双链cDNA通过同源重组（如Gateway技术）或传统的酶切-连接方式，克隆至特定的“猎物”载体中。

第四步：文库的扩增与质量评估

电转化与扩增：将连接产物电转化进高效率的大肠杆菌感受态细胞中，进行大规模培养，以扩增文库。电转化能保证较高的转化效率，是获得高库容文库的关键。

插入片段分析：随机挑选大量单菌落，提取质粒进行PCR或酶切验证，检测cDNA插入片段的长度和比例，确保文库中包含足够数量的全长基因。

2.筛库流程：

第一步：构建诱饵载体：将编码目标膜蛋白（如受体、通道等）的基因克隆到特定的诱饵载体中，该载体使诱饵蛋白与分裂泛素的N端片段融合，并确保其正确锚定在细胞膜上。转化与表达验证：将构建好的诱饵载体转化进入特定的酵母报告菌株（如NMY51）。通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）验证诱饵蛋白能否在酵母中正常表达，且大小正确。

第二步：自激活检测，将含有诱饵的酵母菌在以下两种培养基上划线或点板：双缺培养基（DDO，如SD/-Trp）：仅筛选质粒，所有菌都应生长，确认转化成功。四缺选择性培养基（QDO，如SD/-Trp/-His/-Ade）：施加筛选互作的压力。一个合格的、无自激活的诱饵蛋白在此培养基上不应生长或生长极其微弱。如有自激活，必须优化系统或更换诱饵构建方式，否则会导致后续筛选出现大量假阳性。

第三步：文库扩增与质粒制备，确保使用的cDNA文库（“猎物”文库）质量高、多样性好。通常文库质粒已经构建好，其中每个cDNA都与分裂泛素的C端片段及一个可被切割的报告转录因子融合。需要对文库质粒进行大规模提取和纯化，确保其浓度和纯度适合酵母转化。

第四步：共转化使用乙酸锂法，将大量纯化的“猎物”文库质粒共同转入已经含有并验证过“诱饵”载体的酵母报告菌株中。涂板与培养：将转化后的酵母细胞涂布在四缺选择性培养基（QDO，如SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade） 上。同时，取少量菌液涂布在双缺培养基（DDO，如SD/-Trp/-Leu） 上，用于计算转化效率（即总共获得了多少个独立的转化子）。筛选阳性克隆：在QDO培养基上，只有那些“猎物”蛋白能与“诱饵”膜蛋白发生相互作用，从而重建泛素、释放报告转录因子并激活HIS3和ADE2报告基因的酵母细胞，才能存活并形成菌落。这些在苛刻选择压力下生长出的菌落即为初筛的阳性克隆。

第五步：阳性克隆的回收与验证，挑取与复证：从QDO平板上挑取所有生长的阳性克隆，并重新点种到新鲜的QDO平板和含有X-gal的培养基上进行β-半乳糖苷酶 assay。这是第三重报告基因验证，能进一步排除假阳性，并初步评估相互作用强度的差异。猎物质粒的分离与测序：从经过复证仍为阳性的酵母克隆中提取总质粒，将其转化入大肠杆菌中，利用“猎物”载体特有的抗性标志（如氨苄青霉素）筛选并扩增出单一的“猎物”质粒。最后对质粒进行DNA测序，鉴定出与诱饵蛋白相互作用的蛋白质基因序列。

第六步：点对点验证

将测序得到的特定“猎物”质粒再次与原始的“诱饵”质粒共转化酵母，重复上述的点板验证过程。只有当这个一对一的实验再次产生阳性表型时，才能最终确认这两个蛋白质之间存在特异的相互作用。

②实验周期：约2-3月

③适用场景：

1.构建高质量单/双杂酵母文库 

2.大规模蛋白质相互作用组学研究

3. 验证蛋白间的直接相互作用

④结题标准：构建高质量酵母文库，同时筛选与诱饵存在相互作用的阳性克隆，并测序。 

⑤实验交付内容：

1、酵母文库质粒
2、含有酵母文库质粒的大肠杆菌

3、酵母文库构建与筛库报告与图片

1、严谨的实验过程；

2、严格的结果把控；

3、丰富的项目经验。