酵母单杂交系统主要用于筛选与特定DNA序列结合的蛋白质。其原理是将目标DNA序列（“诱饵”）插入到一个报告基因的上游，并整合到酵母基因组中。然后将一个与转录激活结构域融合的cDNA文库（“猎物”）转入该酵母菌株。如果文库中的某个蛋白能够特异性结合到“诱饵”DNA上，就会招募激活结构域，从而启动下游报告基因（如HIS3, LacZ）的表达。通过检测报告基因活性（例如，能在缺陷培养基上生长），即可从海量文库中筛选出所需的DNA结合蛋白。

酵母双杂交系统则专门用于探测蛋白质之间的相互作用。该体系将两种待测蛋白分别与DNA结合结构域（“诱饵”）和转录激活结构域（“猎物”）融合表达。只有当“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生相互作用时，DNA结合结构域和激活结构域才会在空间上靠近，重新构成一个完整的转录因子，进而激活报告基因的表达。通过将一个未知的“猎物”文库与一个已知的“诱饵”蛋白进行配对，就能大规模地筛选出与之发生相互作用的新蛋白。

①简介： 

实验流程：一、 酵母单杂交筛库步骤（用于筛选与DNA结合的蛋白质）

构建“诱饵”报告基因酵母株：将包含目标顺式作用元件（如特定DNA序列）的多拷贝重复片段，克隆到最小启动子（如GAL1）上游，该启动子控制着报告基因（如HIS3、LacZ）。然后将此构建体整合到酵母基因组中，获得稳定的“诱饵”酵母菌株。

验证“诱饵”特异性：必须确保该“诱饵”菌株本身不激活报告基因（无自激活活性），即在不含组氨酸的培养基上不能生长。准备“猎物”文库：“猎物”通常是一个与强转录激活结构域（如GAL4-AD）融合的cDNA文库，代表了可能结合目标DNA的蛋白质群体。

文库转化与筛选：将“猎物”文库质粒转入“诱饵”酵母菌株中。将转化后的细胞涂布在缺乏色氨酸（用于筛选文库质粒）和组氨酸（用于筛选相互作用）的缺陷培养基（SD/-Trp/-His）上进行第一轮筛选。能够生长的克隆，意味着可能有蛋白质结合了DNA并激活了HIS3报告基因。

二次验证：对初筛阳性克隆进行β-半乳糖苷酶（LacZ）活性测定等更严格的二次验证，以排除假阳性。

结果分析：从阳性酵母克隆中提取“猎物”质粒，进行DNA测序，即可鉴定出与目标DNA序列结合的蛋白质身份。

二、 酵母双杂交筛库步骤（用于筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白质）

构建“诱饵”载体与自激活检测：将已知的“诱饵”蛋白基因克隆到载体上，使其与DNA结合结构域（如GAL4-BD）融合。将该载体转入酵母菌，并检测其在缺乏报告基因选择性压力（如SD/-His）下的生长情况，确保“诱饵”蛋白自身不激活转录（无自激活）。

准备“猎物”文库：“猎物”文库是一个与转录激活结构域（如GAL4-AD）融合的cDNA文库。

共转化与筛选：将验证无误的“诱饵”载体与“猎物”文库共同转入特定的酵母报告菌株（该菌株基因组中含有由GAL4启动子控制的HIS3、ADE2、LacZ等报告基因）。将共转化后的细胞涂布在缺乏色氨酸、亮氨酸（用于筛选两种质粒）和组氨酸、腺嘌呤（用于筛选相互作用）的高强度缺陷培养基（如SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）上进行筛选。

阳性克隆鉴定：能够在如此严格的培养基上生长的大型菌落，表明“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白发生了强烈的相互作用，激活了营养报告基因。

二次验证：通过β-半乳糖苷酶滤膜 assay（X-gal显色）等方对阳性克隆进行再次验证，进一步增强结果可靠性。

结果分析：从阳性酵母克隆中分离出“猎物”质粒，进行DNA测序，从而鉴定出与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。

②实验周期：约2-3月

③适用场景：

1.大批量筛选互作蛋白。

2.大规模蛋白质相互作用组学研究。

3.验证蛋白间的直接相互作用。

④结题标准：在无激活情况下，筛选出互作蛋白。

⑤实验交付内容：

1、诱饵质粒。
2、含有诱饵质粒的大肠杆菌。

3、酵母单杂交/双杂交实验报告及结果分析图片。

1、严谨的实验过程；

2、严格的结果把控；

3、丰富的项目经验。